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RNA純化及獲得

更新時間:2010-01-26  |  點擊率:4109

RNA純化及獲得
純化要求
RNA樣品中不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的有機溶劑和過
高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分
子的污染。排除DNA分子的污染。
純化方法及沉淀
1、有機溶劑抽提法
氯仿抽提:在使用RNA提取試劑進行RNA提取時,常使用氯仿進行
抽提,以去除蔗糖、蛋白等雜質,并促進水相與有機相的分離,從
而達到純化RNA的目的。
沉淀:氯仿抽提RNA后,一般采用異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。
加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇,室溫沉淀
20-30分鐘,高速離心,可獲得RNA沉淀。
洗滌沉淀:加入無RNase的75%乙醇,將RNA沉淀振蕩懸浮,使
RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心10-30分鐘,再次沉淀
RNA。離心后,小心倒掉上清(注意不要倒出RNA沉淀),隨后快速離
心1-2秒,將殘留在管壁上的乙醇收集到管底后,用小槍頭吸凈,超
凈臺中風干1-2分鐘(注意不要晾得太干,否則RNA沉淀不易溶解)。
溶解沉淀:加入適量的RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。
2、硅基質吸附法
隨著實驗方法的改進,現已發展出一種采用吸附材料純化核酸的
方法。目前較常見的有:硅基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁
珠等。硅基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸,使用方便、快
捷,不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優點,成為核酸純化的。
Solarbio公司總RNA提取試劑盒就是采用硅基質吸附達到RNA分離
純化目的。通過專一結合RNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統,
使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結合,而蛋白、有機溶劑等雜質
不能結合到膜上而被洗脫,鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌,后
用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。
一些特殊組織的RNA提取
纖維組織:心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關鍵在于*破碎
組織。這些組織細胞密度低,單位重量的組織中RNA含量較低,建
議增加起始量。此外,一定要在液氮中將組織*磨碎。
蛋白/脂肪含量高的組織:腦或植物脂肪含量高,酚/氯仿抽提后,
上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對上清進行抽提。
核酸RNase含量高的組織:脾、胸腺等組織的核酸和RNase含量很
高。在液氮中研磨,再快速勻漿,能有效滅活RNase,如加入裂解
液后過于粘稠,酚/氯仿抽提不能有效分層,則加入更多裂解液可
以解決此問題。多次酚/氯仿抽提可以去除更多殘留的DNA。如果
加入乙醇后馬上有白色沉淀形成,表明可能有DNA污染,可以在
核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用DNaseI消化,去除DNA
污染,植物組織和真菌組織:植物組織和真菌組織比動物組織更為
復雜,一般選擇在液氮條件下對樣品進行研磨,以避免內源RNase
降解RNA。如果RNA降解問題不能解決,大多數情況下是樣品中含
有的雜質所致。許多植物和真菌中所含雜質如多糖、多酚等都會殘
留,因為這些雜質分子與RNA有一些相似性,可與RNA同時沉淀或
者吸附,因此在植物和真菌組織的提取中,需要用一些特別的步驟
或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質的干擾和污染。




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